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亚虎国际娱乐手机版关于诺贝尔化学奖:冷冻电

文字:[大][中][小] 发布时间:2018-02-10  浏览次数:

  亚虎国际娱乐编者按:皇家科学院颁布发表将2017年度诺贝尔化学奖授予三位科学家,科学家Jacques Dubochet,美国科学家Joachim Frank,英国科学家Richard Henderson,以表扬他们成长了冷冻电子显微镜手艺,以很高的分辩率确定了溶液里的生物的布局!

  正在此,我们转发《物理》的《冷冻电镜单颗粒手艺的成长、现状取将来》一文,供读者领会相关研究环境。

  正在低温下利用透射电子显微镜察看样品的显微手艺,就叫做冷冻电子显微镜手艺,简称冷冻电镜(cryo-electron microscopy, cryo-EM)。冷冻电镜是主要的布局生物学研究方式,它取别的两种手艺:X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)一路形成了高分辩率布局生物学研究的根本,正在获得生物大的布局并其功能方面极为主要。

  电子显微三维沉构手艺发源于1968 年,D.J。 De Rosier 和Aaron Klug 正在Nature 上颁发了一篇关于操纵电子显微镜照片沉构T4 噬菌体尾部三维布局的出名论文,提出并成立了电子显微三维沉构的一般概念和方式。Aaron Klug 本人也由于这个开创性的工做获得了1982 年的诺贝尔化学奖。

  为了降低高能电子对布局的毁伤,Kenneth A。 Taylor 和Robert M。 Glaeser 于1974 年提出了冷冻电镜手艺,而且用于尝试研究。颠末三十多年的成长,冷冻电镜手艺曾经成为研究生物大布局取功能的强无力手段。冷冻电镜素质上是电子散射机制,根基道理就是把样品冻起来然后连结低温放进显微镜里面,操纵相关的电子做为光源对样品进行丈量,透过样品和附近的冰层,透镜系统把散射信号转换为放大的图像正在探测器上记实下来,最初进行信号处置,获得样品的三维布局。

  正在超低温的前提下,电子带来的辐射毁伤被无效节制。即便如斯,样品所能承受的辐射剂量也常低的,导致信噪比很是低。别的,跟着不雅测的进行,额外的电子会累积而形成的挪动,导致获得的图像变得恍惚。这就比如用一个简单的傻瓜相机拍摄正在雨中飞驰的枪弹,获得的影像必然是恍惚的而且充满乐音。因而,冷冻电镜的方式手艺正在很长时间内只能确定个头比力大的样品的布局,好比病毒颗粒的布局,并且凡是分辩率都不高。然而跟着工程手艺和算法的不竭成长,可以或许确定的分辩率也越来越高(图1(a)),2016 年发布的谷氨酸脱氢酶布局的分辩率以至曾经达到了1.8 ?。取此同时,也有越来越多的通过冷冻电镜手艺获得的研究颁发正在高程度的期刊上(图1(b)),冷冻电镜正备受科学界的关心。

  图1 冷冻电镜手艺和单颗粒沉构手艺越来越备受关心(统计数据来历于EMDataBank )(a)分歧年份中操纵冷冻电镜单颗粒沉构手艺可以或许达到的最高分辩率;(b)通过冷冻电镜手艺进行的研究正在分歧上颁发的论文数

  正在比来几年,冷冻电镜手艺有了性的前进,次要得益于三个方面的冲破。起首是样品制备,通过操纵薄膜碳层以至石墨烯能够用更薄的冰层包裹样品来提高信噪比。第二个冲破是电子的探测手艺,也就是电子探测器的发现。正在300 keV 电子的轰击下,保守的器件城市被高能量,因而正在电子探测器呈现之前,冷冻电镜中利用的CCD相机需要将电子打正在探测器上变成光信号,再通过CCD 把光信号转成电信号后获得图像,“电光—光电”转换的过程降低了信噪比。而现正在电子探测器可以或许间接探测电子数量,同时,互补型金属氧化物半导体(CMOS)感光元件的使用使得探测器支撑片子模式(movie mode),能够正在一秒钟之内获得几十张投影图片。通事后期对样品进行漂移批改,再把这几十张图片叠加起来,从而大幅提高成像的信噪比。恍惚的枪弹一会儿变得清晰,冷冻电镜的分辩率不竭上升。第三个冲破是计较能力的提高和软件算法的前进。冷冻电镜的模子沉构凡是需要对几万以至几十万张投影图片进行阐发、拆卸和优化。这需要先辈的计较资本共同无效的算法才能实现。基于贝叶斯理论的模子沉构框架处理了这个问题,我们鄙人文中细致引见。综上所述,冷冻电镜手艺不只提高了空间分辩率,并且能够使用于良多以前不克不及处理的生物大的布局研究。

  具有里程碑意义的是,2013 年大学分校(UCSF) 程和David Julius 的研究组初次获得膜卵白TRPV1 的3.4 ? 近原子级别高分辩率三维布局,成果颁发正在Nature 上。我国正在冷冻电镜的使用范畴也有很大冲破,代表性工做包罗大学的施一公研究组和剑桥大学MRC 尝试室Sjors H.W。 Scheres 研究组合做正在2015 年获得的γ 排泄酶复合物布局( 图2(c)), 以及2015 年大学高宁研究组和科技大学戴碧瓘研究组合做获得的3.8 ? 的线 年大学毛有东研究组、欧阳颀研究组取哈佛医学院吴皓研究组合做获得炎症复合体的高分辩率三维布局(图2(a));2014 年中国科学院生物物理研究所朱平研究组和李国红研究组合做获得的30 nm 染色质左手双螺旋高级布局(图2(b))以及2016 年中国科学院生物物理研究所柳振峰、、章新政三个研究组合做获得3.2 ? 的捕规复合物II 型膜卵白超等复合体布局。这些正在布局生物范畴获得庞大的反应,这也使得冷冻电镜高分辩率成像手艺获得空前的关心。

  图2 我国正在冷冻电镜范畴中获得高质量的研究(a)近原子分辩率的炎症复合体布局(图中NBD为核酸连系布局域,HD1 为螺旋布局域-1,WHD为翼螺旋布局域,HD2 为螺旋布局域-2,LRR为亮氨酸反复序列);(b)30 nm 染色质左手双螺旋高级布局;(c)3.4 ? 的人源γ 排泄酶复合物布局(图中NCT是一种I 型单次跨膜糖卵白,APH-1 为前咽缺陷卵白-1,PS1为早老素-1,PEN-2 为早老素加强子-2)

  图像处置软件的成长对冷冻电镜单颗粒沉构手艺极其主要,当前普遍利用的电镜阐发软件系统次要包罗SPIDER,EMAN2, FREALIGN,SPARX,RELION等。对于方才接触单颗粒沉构手艺的人来说,更偏好集成的软件套拆来完成整个阐发流程。我们正在表1 中列出了大部门支流的分析冷冻电镜图像处置软件,以供参考。

  衬度传送函数(contrast transfer function,CTF)是正在数学上描述通过透射电子显微镜获得样品图像上的像差变化。精确地判断衬度传送函数对于确认显微图像的质量以及后续的三维布局沉建极为主要。常用的估算衬度传送函数的参数软件是CTFFIND4。确定了CTF 的参数当前,就能够对采集到的冷冻电镜图像进行批改。这个批改过程其实就是图像处置中的图像回复复兴手艺。

  接下来需要从原始数据中筛选出颗粒投影,也被称为“颗粒挑选”,颗粒挑选的黑白也将影响所有后续的阐发和处置过程,是一个主要而且繁琐的步调。颗粒挑选体例能够分为手动挑选、半从动挑选和完全从动挑选这几种。

  正在晚期的阐发中,对于布局的领会还很是少,优先考虑的都是人工挑选。可是从动的颗粒图像获取方式的呈现使得正在很短时间内能够收集数十万张颗粒图像,人工挑选大量的颗粒图像不太现实,而且人工的挑选凡是会过于集中于某一类颗粒图像,导致脱漏和误差。

  (1)通过例如降噪、反衬加强、边缘算子等图像形态学方式搜刮区域,基于数字图像处置学的道理,将颗粒图像取布景分分开来。

  (2)基于模板的方式,通过扫描数据图像和已知的模板比力来挑选出潜正在的颗粒图像,模板的来历凡是为手动选出的数据图像中较为清晰的颗粒图像,或者是已知布局的投影。

  跟着图像识别范畴中深度进修方式的风行,各类基于深度进修的颗粒识别框架也被引入到颗粒挑选的过程中。跟着深度进修方式的成长,相信若何把深度进修方式使用到单颗粒冷冻电镜图像阐发范畴的研究将会越来越多。

  二维颗粒图像的分类是获取三维布局过程的第一步。对二维图像的阐发包罗两部门:颗粒图像的婚配和颗粒图像的分类。

  婚配的过程凡是会对颗粒图像使用一些变换操做,通过联系关系函数去判断分歧颗粒图像之间的类似程度。图像婚配的算法次要分为两种,即不依赖模子的方式和基于模子的方式,取决于能否存正在操纵样本先验消息获得的模板。

  跟着图像婚配的完成,颗粒图像需要进行分类。次要操纵多元统计阐发和从成分阐发方式等算法,其他风行的二维颗粒分类手艺还有神经收集分类,将图像正在二维空间自组织映照(self-organising mapping,SOM)再进行分类和排序。

  二维图像阐发的目标是,起首通过图像婚配消弭扭转和平移的误差,操纵类内紧致、类间离散的准绳进行图像分类,最终能够对类内颗粒图像进行平均,提高信噪比,从而实现对高分辩率三维布局的建立。

  模子三维沉构的根本是核心截面,沉构过程中的环节问题是若何确定每个颗粒图像的空间角(orientation determination)。大大都模子沉构和优化算法都是基于投影婚配(projection matching)的迭代方式。简单说就是,先操纵粗拙的三维布局模子,进行投影获得参考的图像,和尝试颗粒图像进行比对,按照成果来更新空间方位参数,继而构制新的三维布局,对尝试图像的空间方位批改,构成迭代的过程,曲至就获得了最终的三维模子。

  正在模子优化的过程中,凡是有良多目标给出布局的分辩率消息。目前一个较为普遍利用的分辩率消息参数是被称为傅里叶壳层联系关系函数(Fourier shell correlation,FSC)曲线,并通过正在曲线上拔取一个合适的阈值来鉴定分辩率。

  正在模子优化中经常伴跟着过拟合的问题。过拟合的呈现凡是因为正在优化过程时无法分辩“噪声”取“信号”。为了避免过拟合对分辩率的误判,比来一种被称为“黄金尺度”(gold standard)的优化过程起头被普遍利用。

  (1)布局分辩率大于10 ? 的生物大布局被视为低分辩率的布局,正在低分辩率的布局范畴内只察看获得一个大致的全体外形,以及有可能分辩出次要成分的彼此关系。

  (2)一个中等分辩率的生物大布局精度大约正在4—10 ?之间,正在这个分辩率范畴内的生物大布局曾经能够获得一些二级布局的消息和分辩出大部门构成布局的相对关系。布局之间若是存正在构象变化也能够分辩出来。

  (3)高精度以至是近原子级此外布局分辩率能够达到4 ? 以下。正在高分辩率的三维布局中,能够精确地看见如α肽链等的二级卵白质布局以及部门零丁的残基,多肽链的布局变得清晰起来。同时高分辩率的布局能够描述切确的构象变化。

  总之,FSC 曲线等尺度供给的分辩率是一个有指点意义的数字,不成做为绝对参考来评价所获得的模子质量,需要地看待,特别是要取生物系统的生物化学学问相连系。

  生物大凡是具有内禀的柔性,所以生物的动态布局变化以及布局的不均一性一曲是布局生物学的研究沉点之一。正在晶体形态下,生物的布局变化被晶格束缚,一般只供给一个静态的布局和无限的动力学参数。冷冻电镜比拟晶体学方式的劣势正在于能够捕获生物正在溶液中的形态,并记实下分歧构象下的投影。因而针对冷冻电镜的数据能够进行多构象的沉构,现有的一些算法是通过聚类阐发、最大似然法阐发等对多构象进行阐发,获得的生物大布局形态和构象差别还需要连系功能来查验布局的合。

  近年来正在单颗粒阐发中取得严沉冲破的该当是最大似然估量(maximum likelihood)理论。最大似然估量的理论能够贯彻整个单颗粒手艺图像阐发的过程,正在图像婚配,2D、3D分类 和模子优化上均能够使用,是一个强无力的理论东西。最大似然估量的算法曾经正在RELION、FREALIGN 等软件中实现,便利通俗用户利用,这对于鞭策冷冻电镜成像手艺的使用有严沉意义,近三四年来有很多冲破性的近原子级别分辩率的布局大多是由基于最大似然估量理论的阐发软件获得。

  最大似然估量较法的计较量很大,若何降低计较量是一个主要问题。过多的计较资本耗损已经障碍这个方式正在冷冻电镜单颗粒沉构中的普遍使用。正在削减最大似然算法正在冷冻电镜使用中的计较需求方面,有两个主要的贡献是空间降维(domain reduction)算法和网格插值(grid interpolation)算法。

  我们比来正在研究一个新的方式来对扭转参数进行分步处置,初步的成果显示这种方式能够把计较复杂度降低一个维度,这个方式可很好地使用于高信噪比的数据处置,但对于低信噪比的数据阐发还需要对该方式进行改良。

  正在将来的研究中,关心点是削减计较的耗时和添加精确度。通用图形处置器(GPU)的使用和CUDA 编程框架曾经显示出了正在高机能计较范畴的能力,研究表白GPU 手艺能够显著削减计较时间,而RELION 也将发布支撑GPU 计较的2.0 版本。

  正在加速计较速度的同时,提高模子的沉构的精确性则更为主要。若何提高颗粒图像的精确性以及最大似然方式正在这些方面的使用还有待深切摸索。总而言之,最大似然方式奇特的、可扩展的统计理论框架能够合用正在冷冻电镜的各类问题上,如多构象、低噪声、消息缺失中均有很好的使用。

  天然界的过程凡是是持续的,好比三磷酸腺苷(ATP)合成酶等布局的形态变化凡是都是持续的。现有的方式只能获得无限的、若干个离散的构象变化,了我们对于布局的进一步察看。而流形嵌入是通过将颗粒图像映照到具有特定拓扑布局的参数空间(manifold space),能够分辩出更为详尽的动力学变化,进而实现对生物持续的布局变化过程的研究。Ali Dashti 等人曾经操纵这种方式成功描绘出核糖体的布局变化径。

  冷冻电镜对更为复杂的布局并没有很好的处置体例,正在一些量比力大,包含多层的病毒布局研究中,一曲没有高分辩率的三维模子,这也是因为病毒遍及具有对称失配的特征,基因布局被壳体完全笼盖,无法通过二维图形处置的体例对内部布局间接进行沉构。刘红荣传授通过改良衬度分手方式展现出领会决该类问题的路子,其成长的新方式曾经成功使用正在一个多面体衣壳NCPV的病毒颗粒(图4)上,通过该沉构方式,使得外部的衣壳布局(图4(a))和内部的基因组布局(图4(b))分手,成功获得包含正在内部的dsRNA 近原子级高分辩率布局和分布。

  图4 操纵衬度分手方式获得对称失背景象下的病毒颗粒布局(a)外部的衣壳布局;(b)内部的基因组布局

  比来的研究显示,最大似然估量较法可以或许更好更快地完成三维沉构,大学的Marcus A。 Brubaker 传授针对最大似然估量较法提出了优化,无效地缩短了三维沉构所需的时间。对保守迭代算法极端依赖于初始模子布局的错误谬误进行改良,同时通过采样优化的体例降低了计较量,削减计较时间,据称这些优化能够达到100000倍的加快,操纵一台计较机工做坐正在一天内就能完成模子沉构。

  冷冻电子显微镜手艺曾经成长成为一个成熟的方式,使用于各类复杂的生物系统的高分辩布局研究。按照目前的成长势头,处理生物布局组(structural proteome)的问题曾经不是高不可攀的了。正在处理单一静态布局的根本上,冷冻电镜也展现了其研究多构象系统的潜力。下面临冷冻电镜正在布局生物学研究范畴的使用做一些斗胆的瞻望,但愿能抛砖引玉。

  因为膜卵白是镶嵌正在磷脂形成的细胞膜内,目前正在冷冻电镜范畴的样品制备还没有很好的处置方式,因而还很少见到对膜卵白的布局解析。跟着手艺的成长,新的试剂或者纳米标准的容器能够用来制备单一性很高的不变的细胞膜以及镶嵌正在内的膜卵白。如许就能够操纵冷冻电镜的方式对膜卵白进行布局研究。目前正在纳米盘(nanodiscs)的研究范畴曾经取得了必然的进展,对

  当前的高分辩布局根基都是正在溶液中提纯出来的样品,也就是凡是所说的in vitro 尝试。现正在能够操纵快速冷冻的方式把细胞固定,再用高能粒子枪对细胞进行高精度切片。正在细胞的某些部位,常常有大量同类堆积,好比正在内质网(endoplasmic reticulum,ER)部门有良多核糖体,正在细胞骨架上会有大量的肌动卵白(actin)。对这些切片进行成像研究能够获取这些正在细胞的布局消息。

  电镜能够用来做断层成像(cryogenic computed tomography,cryo-CT),使用于亚细胞层面的研究,好比细胞器的布局,卵白质的分布,以及一些细胞骨架的形成。取超低温样品操做连系,cryo-CT 能够供给更高分辩率的消息,跟尾层面和细胞层面的学问,对于领会细胞功能至关主要。正在电镜成像研究范畴,这将是一个有广漠前景的课题。

  人们起头不满脚于近原子级别分辩率可以或许供给的消息,想要进一步描绘布局持续变化的形态。得益于冷冻电镜的成像特征,相对其他手艺而言,冷冻电镜手艺正在时间标准的系综上具有劣势。正在冷冻电镜下布局的动力学研究中,有两个值得关心的趋向,别离是可以或许获取布局“ 慢” 反映过程(10—1000 ms) 时间分辩(time-resolved)的冷冻电镜手艺,以及可以或许阐发出持续构象变化的分类算法。获取短期反映过程(10—1000 ms)布局的根本是正在预备样本过程中反映的速度慢于冷冻样本的时间,目前夹杂喷雾(mixing-spraying)等快速冷冻手艺的实现使得一些较慢的反映过程能够看到动力学变化。而流形嵌入算法正在分类过程中取得冲破,正在更好地操纵冷冻电镜察看的均衡态布局动力学变化和展示能景不雅上取得了令人鼓励的。

  生物正在室温下是活跃的,并且大大都的功能是通过布局的变化来实现的。基于X射线, 特别是比来成长的X 射线电子激光(XFEL)的布局生物学的研究沉点之一即是实现时间分辩的布局生物学研究(time-resolved structure determination)。到目前为止,基于X 射线的研究取得了很大的进展,但次要仍是局限正在对晶体的衍射方面,好比对光合感化过程中水分化的研究和光敏黄卵白的光接收过程的研究。三维冷冻电镜的单颗粒成像手艺最有但愿正在单程度上实现对时间分辩的布局变化研究,同时,这对于样品制备和尝试操做提出了很是高的要求。

  冷冻电镜的手艺冲破及其正在生物布局范畴的使用把我们对生物学的研究推进了一大步,起头摸索未知的区域。立脚于处理单一构象的根本,对多构象以及动力学过程和热力学的研究也需要展开,这需要对现有手艺进行提拔并取其他方式进行连系,计较建模和模仿的方式也需要慎密连系起来,实现对生物系统的集成研究。

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